细胞核制备试剂盒
K1011-100次
k1011-500次
描述：在破碎组织细胞时加入活化剂，帮助裂解细胞，反复振荡或使用剪切力释放细胞核，然后在温和条件下低速离心收集细胞核。制备在30-60分钟内完成，无需特殊设备，简便易行，重复性好。适用于从组织块、贴壁或悬浮培养细胞制备完整的高纯度细胞核。制备的细胞核仍然保持其在细胞内时所具有的形状和大小，是进行细胞核组分的亚分级分离和相关实验、研究蛋白核转位、DNA-蛋白相互作用、以及进行Western Blot和免疫共沉淀的理想材料。
组成：100 ml Buffer N1, 5 ml Reagent A, 100 ml Buffer N2, for 100 preparations。
储存：短期4 ºC。可分装出一部分−20 ºC保存。
适用：从组织块、贴壁或悬浮培养细胞制备完整的细胞核。
Step-1A 培养细胞裂解
1. 贴壁细胞需消化或刮下细胞，悬浮细胞可直接离心，PBS洗涤，800 × g 5 min收集细胞。计数，并估计细胞沉淀的体积。每次提取需要1-2 ´ 107个细胞。通常每1 × 107个细胞的沉淀体积约100 µl。
2. 加入10倍于细胞沉淀体积的1 ml冰预冷的Buffer N1，振荡重悬细胞。冰水浴5分钟。
3. 加入1/20体积约50 µl Reagent A，剧烈振荡混合。冰水浴5分钟。再次剧烈振荡。
4. 将细胞裂解物3次或多次通过22号针头剪切，或用小容积间隙紧密的玻璃匀浆器上下研磨20次。在相差显微镜下检查游离的核应达到95%而未裂解细胞应少于5%。否则继续剪切或研磨。
Step 1-B 组织块破碎和裂解
1. 称取100-200 mg新鲜组织如肝脏、脑，PBS冲洗，用剪刀剪为1 cm2碎块放入小容量玻璃匀浆器内。估计组织块总体积。加入1 ml冰预冷的Buffer N1。
2. 用间隙严密的研杵上下研磨培养上下研磨组织10次。冰水浴5分钟。
3. 加入1/20体积约50 µl Reagent A，混合。冰水浴5分钟。剧烈振荡。
4. 在相差显微镜下检查游离的核应达到95%而未裂解细胞应少于5%，否则继续剪切或研磨。
5. 如有必要，用滤纸过滤组织匀浆裂解物。
Step 2 细胞核制备
1. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管。1000 × g 离心3 min 4 ºC沉淀细胞核。弃上清。
2. 用10倍于胞核体积(~0.5 ml) Buffer N2重悬核。2000 × g 离心10 min at 4 ºC。弃上清。
3. 重复步骤2洗涤细胞核。在相差显微镜下胞核应游离分散在清亮背景下。存在颗粒物质表明细胞质成分；核聚集表明存在粘连性的细胞骨架或染色质，通常由于细胞匀浆破碎不足或起始细胞数太多。
4. 弃上清。用50-100 µl适宜的缓冲液重悬细胞核，进行下一步实验。或将胞核沉淀直接− 70 ºC保存。
注意：
1. 破碎细胞是关键环节。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁细胞较难破壁。组织细胞裂解物3次或多次通过22号针头剪切破碎细胞，或用小容积玻璃匀浆器、间隙紧密的研杵上下研磨培养20次。用相差显微镜检查未裂解细胞应少于5%。否则继续剪切或研磨。
2. 以离心力g计算正确的离心速度。
3. 加入何种缓冲液重悬细胞核，取决于用户后续的实验。
4. 进行Western Blot和2D-胶电泳，可先用小体积的水重悬核沉淀，然后加入样品缓冲液，如果直接用含SDS的缓冲液裂解核将释放大量粘稠的DNA使样品难以分散。反复加热变性有助于DNA断裂，可通过细针头反复抽吸打断DNA。免疫沉淀时可直接加入IP缓冲液。
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