蛋白抽提试剂盒-I
K1003-100次
描述：从组织细胞中提取总蛋白是Western Blot的关键步骤。实体软组织如脑脊髓富含磷脂，神经血管含大量结缔组织，而脂肪则有大量油脂，常规的方法难以有效从这些组织提取蛋白。本试剂盒为组织或培养细胞总蛋白提取提供完整的解决方案。用裂解-结合缓冲液匀浆裂解实体组织，或直接用裂解-结合缓冲液重悬培养细胞，然后加入抽提试剂去除非蛋白成分，离心、干燥后即可得到总蛋白。蛋白沉淀溶解后用常规方法进行蛋白定量。提取过程可在30-60分钟内完成，可在1.5ml离心管微量提取也可大规模制备，极为简便高效。通常一次提取10-100mg组织所获得的总蛋白可进行几十到上百次分析如蛋白质电泳、Western Blot、免疫共沉淀。
组成 1. 裂解-结合缓冲液 100 ml 2. 抽提试剂 100 ml
每毫升裂解缓冲液和抽提试剂可提取10-100mg组织或1 ´ 107细胞。试剂盒的裂解缓冲液是过量的。
适用 各种实体软组织(> 1 mg)，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道组织、肾脏、
心脏、肌肉、血管、结缔组织等，以及各种原代细胞和永生化细胞系。
保存：室温或4ºC保存2年
固体组织蛋白提取
1. 每10-100mg固体组织剪碎后加入0.5-1 ml裂解液，放入玻璃匀浆器内上下手动匀浆15次；或用高速机械匀浆器12,000 rpm 破碎组织。注意：初始组织的量应在10-100mg范围。肝肾组织蛋白含量高，提取时应加较少量的组织，否则形成的蛋白膜厚、致密且难溶。少量小的未破碎组织不影响后续抽提。
2. 仅取0.5ml组织匀浆液转移到1.5ml离心管，弃去剩余的组织匀浆液。每0.5ml组织匀浆液加入2倍体积的(1 ml)抽提试剂充分混匀。室温或4ºC静置10分钟，偶尔晃动。注意：(1)如组织量<10mg，在下一步离心时形成的蛋白膜易碎，静置30min有助蛋白膜形成。(2)提取脂肪组织时应4ºC静置40min以上以充分去除油脂。(3) 0.5ml组织匀浆液获得的蛋白足以进行几十次Western Blot。保证每0.5ml组织匀浆液加入2倍体积的(1 ml)抽提试剂是成功的关键。
3. 10,000g 4ºC离心10分钟，溶液分为上下两相，两相中间为蛋白膜。吸除上层液体；随后用吸头或针头轻轻拨开蛋白膜，吸除下层液体。蛋白膜将附着于离心管壁。注意：(1)离心速度过高将使蛋白膜过于坚固，难以溶解。(2)如果不能分相，可再加入50ml蒸馏水混匀离心。 (3)如果初始组织量较少(<10mg)，离心后难以得到完整的蛋白膜，此时可吸去上下层液体，加入1ml纯乙醇混匀，10,000g 4ºC离心3分钟。弃所有液体，蛋白沉淀在管底。
4. 敞开管口，室温10分钟空气干燥沉淀。
5. 每100mg组织所得到的蛋白加 200-1000ml用户自备的缓冲液，95ºC煮10分钟。室温放置20~60分钟溶解沉淀。参见后面的说明。
培养细胞蛋白提取
参见固体组织蛋白提取程序中的斜体字注解
1. 消化洗涤并800 g离心收集细胞。每5-10 x 106细胞加入0.5 ml裂解液，振荡重悬，4ºC净置2分钟。
2. 按比例每0.5 ml裂解液加入1 ml抽提试剂，振荡混匀。4ºC静置10min。
3. 10,000g 4ºC离心10分钟，溶液分为两相，两相中间为蛋白膜。小心吸除上层相和大部分下层相，保留两相中间的蛋白絮状物。如果不能分相，可再加入50ml蒸馏水混匀离心。
4. 加入1 ml纯乙醇洗涤沉淀。10,000g 4ºC离心3分钟，蛋白沉淀在管底。
5. 去除管中所有液体，敞开管口，室温空气干燥沉淀。
6. 每1 x 106细胞可加入 50-200 ml (或适量)的蛋白溶解缓冲液，95ºC煮5-10分钟，室温放置20-60 分钟溶解沉淀。离心除去不溶物。
说明
1. 未溶解的蛋白沉淀不含盐、去垢剂、和还原剂成分。干燥蛋白沉淀可4ºC或－20ºC长期保存。
2. 蛋白沉淀溶解步骤：(1)溶解于去离子水或用户自备的缓冲液，95ºC煮10分钟。室温放置30~60分钟或4ºC溶解5小时以上至过夜。12000rpm离心5 min去除任何不溶性沉淀。没有去垢剂时沉淀溶解缓慢且某些膜/疏水蛋白不能完全溶解。(2)有效的溶解推荐用此法，用2~5% SDS水溶液、或含5%SDS的自备缓冲液，或含2%SDS的标准SDS-PAGE凝胶上样缓冲液，95ºC 10分钟。沉淀量少会很快溶解。如沉淀很多或过分干燥，煮沸后4ºC溶解5小时以上或过夜，可溶性蛋白应该溶解并释放到溶液中。4ºC溶解过夜的不溶物主要是不溶性成分，通常不含对实验有用的可检测蛋白。12000rpm离心5 min去除任何不溶性沉淀。但对于绝大多数Western Blot目的，按照上述溶解过程可不加蛋白酶抑制剂，而蛋白不会有明显降解。但用户仍然可以加入蛋白酶抑制剂。注意染色体DNA可与蛋白质一起被抽提出来，溶解时形成粘稠物。含有大量粘稠DNA的样品在进行电泳时易导致条带变形。95ºC热变性、振荡、注射针头反复抽吸有助于彻底打断DNA。
3. 蛋白沉淀溶解体积。按照每mg组织2~5ml的比例决定最终的溶解体积，但需要依据组织类型和实验目的改变。过小的溶解体积将使沉淀难以快速有效溶解。样品中的蛋白浓度也可用每单位体积(ml)内的精确的组织初始重量(mg)或细胞数量来表示，通常这种表示方法与蛋白定量结果有很好的平行性。
4. 蛋白定量。根据上述溶解方法溶解，不含染料，稀释后定量。注意使SDS浓度稀释到不影响蛋白定量的水平，或选择不受SDS影响的测定方法。BCA法<5% SDS浓度，Bradford法<0.125% SDS浓度。
5. 蛋白样品与2-5´标准SDS-PAGE Loading Buffer 混合即可直接上样电泳。
6. 按比例可进行大规模的组织(～1g)蛋白提取。
7. 提取试剂有刺激性，一旦接触立即用水清洗。
8. 试剂盒提供的裂解-结合缓冲液是过量的。
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