Hifectin II 真核细胞转染试剂
H1003-250UL
H1003-500UL
H1003-1ML
描述：Hifectin II转染试剂由阳离子聚合物组成，能与带负电的核酸磷酸基团形成稳定复合物，通过内吞作用进入细胞。在细胞内，该阳离子聚合物能缓冲溶酶体pH保护核酸免受降解，并将核酸转运到胞浆和细胞核。Hifectin II具有转染效率高，操作简单，适用范围广，细胞毒性低、重复性好等特点。可转染质粒DNA、RNA、寡聚核苷酸。与另一类阳离子脂质体转染试剂相比， Hifectin II可以进行有血清转染和整体动物的在体转染；也特别适宜转染神经细胞、上皮内皮细胞等原代或传代培养细胞。包括：CHO、BHK、HeLa、A497、A549、HEK293、Vero、f9、PC12、COS-1、COS-7、NIH3T3、L929、HepG2、5HSY-5Y、K562、MCF7、CaCo2、RAW 264.7、SH-SY5Y、MRC-5、原代神经元、人原代皮肤成纤维细胞或脐带静脉内皮细胞、牛原代主动脉内皮细胞等。
规格： Size 24-well 6-well/35-mm plate 60-mm plate
0.25 ml 125-250 次转染 62 次转染 25-50 次转染
0.5 ml 250-500 次转染 125 次转染 50-100 次转染
1 ml 500-1000 次转染 250 次转染 100-200 次转染
适用：转染DNA、RNA、寡聚核苷酸于传代或原代真核细胞、动物在体转染。适于有血清转染。
储存：常温运输，收到后4°C保存1年。
自备试剂：过滤除菌无血清DMEM或者生理盐水，用以稀释DNA和Hifectin II。
细胞准备：转染前一天传0.5-1 x 105细胞于24孔板，加1 ml正常培养基培养。在光镜下观察细胞，当细胞群覆盖培养瓶皿生长表面的80~ 90%时，为Hifectin II转染的最佳时机。这通常需要24小时，但依细胞类型和接种量而变。传代时接种细胞过密或100%长满的细胞的转化效率明显降低。
表一 转染步骤及细胞数、DNA、转染试剂、培养基用量优化参考表
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Step 1 |
Step 2 |
Step 3 |
Step 4 |
Step 5 |
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Dilute DNA |
Dilute Hifectin II |
Mixture |
Add to Medium |
Transfection Mixture |
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Culture |
Area |
Cell |
DNA |
Serum-free |
Hifectin II |
Serum-free |
Add Hifectin II |
Fresh Medium |
(Step 3 + Step 4) |
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Vessel |
cm2 |
Numbers |
µg |
DMEM |
µl |
DMEM |
to DNA |
volume per well |
Final Volume |
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96-well |
0.3 |
1 ´ 104 |
0.25 µg |
7.5 µl |
0.2-0.4 µl |
7.5 µl |
15 µl |
80-100 µl |
100-115 µl |
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48-well |
1 |
5 ´ 104 |
0.5 µg |
15 µl |
0.5-1 µl |
15 µl |
30 µl |
160-200 µl |
200-230 µl |
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24-well |
2 |
1 ´ 105 |
1 µg |
30 µl |
1-2 µl |
30 µl |
60 µl |
400-500 µl |
460-560 µl |
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12-well |
4 |
2 ´ 105 |
2 µg |
50 µl |
2-4 µl |
50 µl |
100 µl |
0.5-1 ml |
0.6-1.1 ml |
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6-well |
10 |
5 ´ 105 |
4 µg |
100 µl |
4-6 µl |
100 µl |
200 µl |
1.5-2 ml |
1.7-2.2 ml |
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35-mm |
10 |
5 ´ 105 |
4 µg |
100 µl |
4-6 µl |
100 µl |
200 µl |
1.5-2 ml |
1.7-2.2 ml |
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60-mm |
30 |
1 ´ 106 |
10 µg |
250 µl |
10 µl |
250 µl |
500 µl |
4-5 ml |
4.5-5.5 ml |
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10-cm |
75 |
5 ´ 106 |
15 µg |
500 µl |
15 µl |
500 µl |
1000 µl |
8-10 ml |
9-11 ml |
优化：为避免细胞毒性，最终与细胞接触的转染培养基(Step 5)中Hifectin II的终浓度应小于6 µl/ml (表中为2~4 µl/ml)；DNA终浓度应小于4 µg/ml (表中为~2 µg/ml)。首先优化DNA重量与Hifectin II的体积比(表中推荐1:2)为1:1~1:3。1µg DNA对应1.25、1.5、2、2.25、2.5、2.75、3 µl Hifectin II (以0.25-0.5µl为步长精确优化)。确定合适的比例后，再分别增减DNA或Hifectin II的用量进行优化。为方便加样可选取整数培养基体积。
转染步骤 (参见表一)：
推荐DNA 重量与Hifectin II的体积之比为1:2。以下的方案以24孔板的单孔贴壁细胞为例。可将转染混合物与培养基预先混合于较大体积，然后分别加到各个培养孔内。
1. 稀释1µg质粒DNA于50 µl无血清DMEM，轻轻振荡混匀。参见表一Step 1。
2. 稀释2µl Hifectin II于50µl无血清DMEM，轻轻振荡混匀，室温放置10分钟。按照每1 µg 质粒DNA加入2µl Hifectin II的比例，确定Hifectin II 的加入量。参见表一Step 2。
3. 按顺序将50µl 稀释的Hifectin II加入到50 µl稀释的DNA溶液中，参见表一Step 3。轻轻振荡混匀。室温孵育15~30分钟。
4. 趁此时间可按照表一Step 4推荐的量，更换新鲜培养基。a) 无血清转染：PBS洗涤换液，24孔板每孔加入0.5 ml 无血清培养基。b) 有血清转染：换液，24孔板每孔加入0.5 ml 含10%血清的正常培养基。
5. 将转染混合物加入细胞，参见表一Step 5。a) 无血清转染：将100µl 转染混合物轻轻滴加到培养孔内与已有的培养基混匀，晃动混匀。b) 有血清转染： 将100µl 转染混合物轻轻滴加到培养孔内与已有的培养基混匀，晃动混匀。然后直接进行步骤8。所有商品化转染试剂均受血清复杂成分影响。Hifectin II标准转染程序是无血清转染，但能进行有血清转染，可预试验确定细胞类型是否适合有血清转染。
6. 放入CO2培养箱37°C孵育4小时。长时间孵育略增加转染效率但明显增加细胞毒性。
7. 吸除转染混合物，加1 ml 正常血清培养基。
8. CO2孵箱37°C继续培养24-48小时表达基因。观察细胞，进行下一步实验。或1:10稀释传代，培养基加1200 µg/ml G418筛选。
悬浮细胞转染
通常悬浮细胞以高密度生长，因此可考虑多加一些DNA。参照上述贴壁细胞转染方法和表一推荐种细胞、加培养基、制备DNA-Hifectin II转染混合物。细胞种植1-2小时后将DNA/Hifectin II 复合物加入到培养基混匀。继续培养24-48小时。如毒性明显可于转染后4小时400g离心收集并重悬细胞，继续培养24-48小时。收取细胞进行下一步实验。
寡聚核苷酸转染（以24孔板的单孔贴壁细胞为例，参见表一）
1. 用无血清DMEM配制25 µM 寡聚核苷酸溶液，根据培养皿面积和细胞数确定溶液体积(参见表一)。然后计算该体积下寡聚核苷酸的µg数。可按前述方法优化寡聚核苷酸的最佳加入量。
2. 按每1µg 寡聚核苷酸使用2µl Hifectin II的比例计算所需Hifectin II的µl量。将Hifectin II稀释于无血清DMEM混匀。稀释的Hifectin II终体积与步骤1配制的寡聚核苷酸溶液的终体积相同。可以按照前述的方法优化Hifectin II的最佳加入量。
3. 按照顺序，将稀释的Hifectin II转染试剂加入稀释的寡聚核苷酸溶液中，得到浓度为12.5µM寡聚核苷酸-Hifectin II溶液。
4. 立即轻轻振荡混匀。室温孵育15-30分钟。
5. 确定待转染细胞的培养基体积。将步骤3-4制备的12.5µM寡聚核苷酸-Hifectin II溶液1:10滴加稀释于培养基中，混匀。与细胞接触的寡聚核苷酸的终浓度为1.25µM。
6. 放入CO2培养箱37°C孵育4小时。勿长时间孵育。
7. 吸除转染混合物，加1 ml 正常血清和抗生素的培养基。
8. CO2培养箱37°C继续培养24-48小时，收取细胞进行实验。或培养基加1200 µg/ml G418筛选。
整体动物在体转染程序 (适用于DNA、siRNA、寡聚核苷酸)：
在体转染程序的关键在于优化：(1)DNA的量；(2)Hifectin II的量；(3) DNA-Hifectin II复合物的最终体积。然而，采取何种方法将DNA-Hifectin II输送到体内，以及输送到体内的什么部位，将显著影响最终转染结果。例如，尾静脉或门静脉注射、脑脊液内注射、肺吸入、骨骼肌和心肌注射等不同因素，不仅影响转染效率，甚至影响外源基因的表达效率。对这些因素深入细致研究和分析是成功进行在体转染的关键。
1. 稀释50 µg质粒DNA于200µl生理盐水，混匀。注意进行预试验优化质粒DNA的量。
2. 按照1µg质粒DNA使用1.5 µl Hifectin II的比例，取75 µl Hifectin II与125µl生理盐水混合，振荡混匀。注意进行预试验优化加入Hifectin II的量。
3. 按照顺序，将200µl 稀释的Hifectin II转染试剂加入200µl稀释的质粒DNA溶液中。
4. 立即轻轻振荡混匀。室温孵育15-30分钟。
5. 采用合适的方法将转染混合物输送到体内。24-48小时后检查转染基因表达。
表二：小鼠在体转染DNA用量和最大注射量参考
尾静脉和心脏：50µg DNA用量/200-400µl最大注射量。门静脉：50µg DNA用量/1000µl最大注射量。皮下：10µg DNA用量/100µl最大注射量。脑室：1-3µg DNA用量/2-5µl最大注射量
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