一氧化氮检测试剂盒
W1006-500次
一氧化氮(Nitric oxide，NO)是重要的气体信号分子和效应分子，作为第二信使参与许多生物效应和生理病理过程。体内NO含量低，半衰期短，且易被氧化。Griess反应一直是最经典的生物样品NO测定方法，反应产物的光密度OD值与NO浓度呈线性关系。本试剂盒基于Griess 反应原理，采用优化的反应条件和比色法测量液体样品NO的浓度。方法简单，线性范围2.5~800µM。按照每150 µl反应体系含50 µl样品推算，相当于样品的检测灵敏度约为300 pmol/50 µl。
适用：
液体生物样品如血液、尿、培养基中的NO检测。
组成与储存：(500 assay)
1. NaNO2标准品 0.5 ml (100 mmol/L)
2. Griess R1 25 ml
3. Griess R2 25 ml
4ºC避光保存4个月。
所需设备：
96孔酶标板，可见光分光光度计，最大吸收峰540nm处。可在490-550 nm间测定但灵敏度略降。
准备步骤：
测定前取出试剂升温到室温。
标准品稀释：每次测量均新做标准曲线，用与样品相似的液体稀释标准品。
A. 取100 mmol/L NaNO2标准品8µl，加到992µl蒸馏水中，得到1000µl之800 µM管。
B. 从800 µM管取200µl加入200µl蒸馏水得400µM管，然后依次取样用蒸馏水倍比稀释，得到200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56 μM管。最后设置不加标准品的0浓度管。
C. 从以上各管各取50 µl 加入酶标板。
D. 等待后续加入样品，以及加入Griess试剂后，一起反应并测量。
样品测量：
取50 µl标准品或样品，加入96孔板中。2. 每孔加入50 µl Griess R1
3. 优化步骤：室温避光放置5分钟。此步骤可进一步提高灵敏度。但NO浓度较高时可省略。
4. 然后，每孔加入50 µl Griess R2。
5. 室温避光放置5分钟。
6. 540 nm (490-550 nm均可)测定吸光度。应在30 min内测完，以免退色降低灵敏度。
7. 制备标准曲线：以平均吸光度OD值为x轴，标准品浓度为y轴，用Excel做图并得到标准曲线公式。
8. 将样品OD值代入公式计算NO浓度。
说明：
1. 在30 min内测完，以免退色而降低灵敏度。
2. 快速测定：如果样品NO浓度较高，则可将Griess R1和R2预先1:1等体积混合；然后各取100 µl混合试剂与50 µl样品反应测定。
3. 样品所赖以存在的液体的内在成分会干扰测定，降低OD值和灵敏度。干扰程度：尿液>血清>血浆>培养基>蒸馏水。
4. 每次测量必须新做标准曲线，尽量用与样品相同的液体稀释标准品。
5. 细胞培养基中酚红的红色颜色不影响测定。
参考文献：
1. Bredt, D.S. and Snyder, S.H. (1994) Nitric oxide: a physiologic molecule. Ann. Rev. Biochem. 63, 175
2. Griess, P. (1879) Chem. Ber. 12, 426.
