乳酸脱氢酶LDH活力定量测定试剂盒
W1005-100次
一、原理
以氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)作氢受体，乳酸脱氢酶催化乳酸脱氢生成丙酮酸，丙酮酸与
2, 4—二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，后者在碱性溶液中显棕红色。颜色深浅与丙酮酸浓度成正比，由此推算乳酸脱氢酶活性单位。
二、试剂盒组成
1． 试剂A：底物缓冲液，12 ml, 4℃ 避光保存1年。
2． 试剂B：11.3 mmol/L氧化型辅酶Ⅰ溶液，2 ml, –20℃ 保存，4℃可保存6周，
3． 试剂C：1mmol/L 2, 4—二硝基苯肼溶液，10 ml, 4℃ 避光保存半年以上。
4． 丙酮酸钠标准品母液 (5 μmol/ml)，0.5 ml, –20℃ 保存；
5． 终止试剂：0.6 mol/L NaOH , 30 ml, 常温保存。
三、操作步骤
1．取10 μl标准品或样本加入到微孔板中。
2．底物缓冲液与氧化型辅酶Ⅰ溶液以5:1的体积比混合，取60 μl混合液加到各孔，充分混匀；37℃水浴15分钟。
3．加入2, 4—二硝基苯肼溶液50 μl，与标准品或样本充分混合；37℃水浴15分钟。
4．加入150 μl 终止试剂，充分混合。
5．室温放置3分钟后，440nm波长处测定。
四、标准曲线的制作
临用前将丙酮酸钠标准品母液用底物缓冲液稀释成2.5、2、1.5、1、0.5、0.25、0.125 μmol/ml 7个浓度，稀释液4℃可保存一周。丙酮酸钠浓度与乳酸脱氢酶活力单位的对应关系见下表。
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丙酮酸钠浓度 (μmol/ml) 0 0.125 0.25 0.5 1 1.5 2 2.5 |
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相当于乳酸脱氢酶活力单位 0 125 250 500 1000 1500 2000 2500 |
丙酮酸钠0 μmol/ml的孔只加10 μl底物缓冲液，以此孔作为空白孔调零，440nm波长
处读取各孔吸光度，与其相应的酶活力单位作图，得出标准曲线。
五、样本处理
一）体液处理
血清用生理盐水作1：10稀释；脑脊液内乳酸脱氢酶活力较低，直接以原液测定即可；其他体液也需1：10稀释后测定。
二）细胞处理
细胞用1% Triton X-100裂解，取10 μl细胞裂解液用于测定；细胞培养基可直接用于测定。
六、单位定义
每100m1血清中的LDH在37℃与底物作用15分钟，能生成一微摩尔丙酮酸者即为一个乳酸脱氢酶活力单位。
以第四管为例，丙酮酸含量为0.005微摩尔，如稀释后的血清测定结果相当于第四管的光密度时，因稀释前的血清用量为0.001ml，换算成100ml时就相当于乳酸脱氢酶活力
500单位／dl；
如果血清未经稀释，测定结果相当于第四管光密度时，说明0.01ml血清在37℃与基质作用15分钟生成0.005微摩尔丙酮酸，换算成100ml血清就相当于产生了50微摩尔丙酮酸，乳酸脱氢酶活力单位为50U/dl, 即测得的酶活力单位除以稀释倍数10得实际的酶活力单位。
七、结果处理
440nm波长处读取样本孔吸光度，根据标准曲线算出酶活力单位，即为测定的酶活力单位。
一） 体液
作1：10稀释后测定的体液的实际酶活力单位即是测定的酶活力单位；
未经稀释的体液的实际酶活力单位=测定的酶活力单位/10；
二） 细胞活力计算
细胞活力用LDH释放率来表示，后者值越大，表示细胞活力越差，受损程度越严重。
细胞LDH释放率（%）=细胞培养基中测定的酶活力单位/（细胞裂解液测定的酶活力单位+细胞培养基测定的酶活力单位）×100%
八、参考值
人血清LDH：190~310U/dl
九、注意事项
1．红细胞内乳酸脱氢酶活力较血清内约高100倍．故标本有轻微的溶血．测定的结果会比实际的结果高数倍。
2. 草酸盐可抑制乳酸脱氢酶活力，故不能用草酸盐抗凝血浆测定。
3．测定结果超过2500U时，应将样本继续稀释后重新测定。
4．该方法以乳酸盐和NAD+为底物，其优点是乳酸盐及NAD+底物液稳定，冰箱保存时可稳定半年以上，反应的线性范围较宽。
