血液甘油三酯酶法测定试剂盒
W1003-250次
描述：甘油三酯由甘油与脂肪酸酯化物，是血脂的主要成分，是机体重要的供能物质。在病理条件下，各种组织细胞合成和储集的甘油三酯显著增加。高甘油三酯和高胆固醇血症是临床最常见的高脂血症，与多种疾病有关。试剂盒采用甘油磷酸氧化酶法与经典GPO Trinder酶学反应测定甘油三酯含量，符合世界卫生组织(WHO)、美国FDA、中国《全国临床检验操作规程》规定的甘油三酯临床检验标准。改进后可以测定血液、组织、细胞内、食品饮料甘油三酯含量，灵敏度高，线性范围20~2000 µmol/L。
测定原理：(1) 脂肪酶分解血清中甘油三酯为甘油。(2) 甘油激酶将甘油磷酸化生成3-磷酸甘油。(3) 后者被磷酸甘油氧化酶氧化生成磷酸二羟丙酮和过氧化氢。(4) 在过氧化物酶催化下生色底物转化为苯醌亚胺，光密度值与甘油三酯浓度成正比。
用途：测定血液、组织、细胞内、食品饮料甘油三酯含量。
组成 (250次微板测定或85次1 ml比色杯测定)
(1) R1 40 ml，(2) R2 10 ml， (3) 4 mM甘油标准品1 ml。4 ºC避光储存3月。
所需设备：721、722型可见光分光光度计、酶标仪、生化分析仪。最佳工作波长550nm，如仪器无此波长建议优先选用570、530、490nm。比色杯光径1cm。
样本处理
血液：新鲜血液4ºC 2000 g离心5 min得到血浆，非抗凝血4ºC放置2小时得到血清。血浆或血清可直接测定。如超过线性范围用蒸馏水或生理盐水1:1～1:5稀释后测定。
组织细胞裂解液: 用户自备(Tris-Cl 20 mM，pH 7.4, EDTA 1 mM, 1% Triton X-100)。蛋白定量：由于含有1% Triton X-100，请使用BCA蛋白定量试剂盒
原代成熟脂肪细胞：用预温PBS洗涤细胞1-2次去除释放的甘油，每次200g 5min收集细胞。管壁上可能粘附有破损细胞释放的甘油三酯(油滴)，因此须避开油滴，将细胞悬液转移到新的1.5 ml管。每100µl 压积 (packed cell volume, PCV)脂肪细胞加入0.1 ml组织细胞裂解液。剧烈振荡使细胞完全裂解。加入0.9ml 蒸馏水和或生理盐水振荡混匀。4°C 12 000 g离心10分钟，取10µl取下层清液，待测。测量的细胞量为1 µl PCV细胞，量可自行增减。最终测量值乘以稀释倍数，除以每ml细胞压积PCV或每毫克胞浆蛋白表示。
分化脂肪细胞或非脂肪细胞： PBS洗涤细胞2次去除细胞释放的甘油，每5~10 x 106个细胞加0.5ml ml 组织细胞裂解液。转移到1.5 ml离心管，剧烈振荡，加入0.5 ml 蒸馏水或生理盐水振荡混匀。4°C 12 000 g离心10分钟，取10µl取下层清液，待测。最终测量值乘以稀释倍数，除以细胞数或mg蛋白量校正。
组织：减量法精确称重100mg组织，PBS洗去血液。每1mg组织加入10 µl 组织细胞裂解液(自备，见前)，用玻璃匀浆器匀浆裂解。4°C 12 000 g离心10分钟，取10µl取下层清液，待测。最终测量值乘以稀释倍数，对应于每毫克组织蛋白表示。
配制工作溶液：按4:1比例，取4 ml试剂R1与1 ml试剂R2混合即可，立即使用或4ºC保存<1天，变色弃去。
标准品稀释：4 mM甘油标准品用蒸馏水或与样本缓冲液一致的液体倍比稀释为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625µM。注意设置0浓度对照反应管。
甘油三酯测定
1. 参见下表加样。先加标准品或待测样品，后加工作溶液。用户可依据甘油三酯含量高低小范围调整样品与工作液体积比例。但样品加入过多将出现干扰并稀释酶浓度而降低灵敏度。超出线性范围可适当稀释，根据实际稀释倍数计算浓度。
2. 37ºC 20min (15~30min)。或25ºC室温反应30 min但灵敏度略降。反应平衡后颜色在60 min内稳定。
3. 先用蒸馏水空白管调零，然后测定各管OD值。
4. 绘制标准曲线并计算甘油三酯浓度。Excel作图步骤：各标准管OD值为y轴，标准品浓度为x轴。(1)鼠标左键圈住数据，点击做图向导，选择-散点图-，点击-完成-。(2)鼠标右键点图上的某一点，点击-添加趋势线-，点击-选项-，点击-显示公式-和-R2值-。
表 加样比例 (线性范围20－2000 µmol/L)
(可微量调整样品与工作液体积比例)
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微板测定 |
1 ml比色杯测定 |
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空白 |
标准 |
样本 |
空白 |
标准 |
样品 |
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蒸馏水µl |
3 |
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210 |
200 |
200 |
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标准品µl |
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3 |
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10 |
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样品µl |
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3 |
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<> |
