液体样品甘油含量GPO-POD酶法测定试剂盒
W1002-500次
描述：甘油是甘油三酯的水解产物。甘油三酯水解生成1分子甘油和3分子游离脂肪酸，称为脂肪分解。脂蛋白酯酶水解血中甘油三酯；胰脂酶水解食物中的甘油三酯；激素敏感脂肪分解酶水解脂肪细胞中的甘油三酯。与游离脂肪酸一样，甘油含量是甘油三酯水解反应的可靠检测指标，但检测更加方便。本试剂盒采用甘油磷酸氧化酶法与经典GPO Trinder酶学反应1，通过比色测定液体样品甘油含量。试剂盒经过优化使得操作简单，最低检测灵敏度10 µmol/L，线性范围10~1200 µmol/L，可靠性和重复性俱佳。适合生物医学、食品实验室检测。
原理：在ATP存在下甘油被甘油激酶磷酸化为3-磷酸甘油，再被甘油磷酸氧化酶氧化产生过氧化氢；在过氧化物酶作用下生色底物转化为苯醌亚胺，光密度值与甘油浓度成正比。
用途：测定血液、细胞培养基、体液、消化液、各种组织细胞匀浆液、酒类、饮料中的甘油浓度。
组成：(1) R1 40 ml；(2) R2 10 ml； (3) 4 mM甘油标准品1ml；4ºC避光3月。300~500次微板测定或100次1 ml比色杯测定。
所需设备：(721、722型)可见光分光光度计、酶标仪、生化分析仪。最佳工作波长550nm，如无此波长建议优先选用570、530、490nm。比色杯光径1cm。
样本处理
1. 酒类、饮品、清澈体液样本：直接测定，如超过线性范围用蒸馏水或生理盐水稀释后测定。
2. 培养液：取不含酚红无颜色无血清的细胞培养基液，如有细胞碎片应4ºC 12,000g离心5 min清除，取上清测定。
3. 血液：新鲜抗凝血4ºC 2000g 5 min得到血浆，或非抗凝血4ºC 2小时取血清。2000g 10min除去血细胞。70ºC 10 min灭活内源性脂蛋白脂肪酶，再次12,000g 10 min，取上清测定或−20ºC保存。
配制工作溶液：按4:1比例，取4 ml试剂R1与1 ml试剂R2混合即可，立即使用或4ºC保存<1天，变色弃去。
标准品稀释：用蒸馏水、生理盐水或与样品缓冲液一致的液体，将4 mM甘油标准品倍比稀释为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 µmol/L，通常取其中4~6管即可，注意设置0浓度对照反应管。
甘油测定
1. 参见下表加样。先加标准甘油或待测样品，后加工作溶液。甘油浓度很低时，可尝试样品与工作液体积100:100µl能否进一步增加灵敏度，但样品超过100µl将稀释酶浓度而降低灵敏度。超出线性范围可适当稀释，根据实际稀释倍数计算浓度。
2. 37ºC 20min (15~30min)。或25ºC室温反应30 min但灵敏度略降。反应平衡后颜色在60 min内稳定。
3. 先用蒸馏水空白管调零，然后测定各管OD值。
绘制标准曲线并计算甘油浓度。Excel作图步骤：各标准管OD值为y轴，标准品
4. 浓度为x轴。(1)鼠标左键圈住数据，点击做图向导，选择-散点图-，点击-完成-。(2)鼠标右键点图上的某一点，点击-添加趋势线-，点击-选项-，点击-显示公式-和-R2值-。
表1 酶标微板测定的加样比例 (检测范围10~1200 µmol/L)
(可微量调整样品与工作液体积比例)
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培养基或低甘油浓度样品测定 |
高甘油浓度样品测定 |
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空白管 |
标准管 |
样本管 |
空白管 |
标准管 |
空白管 |
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蒸馏水/生理盐水 |
50 µl |
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5 µl |
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标准品 |
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50 µl |
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5 µl |
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样品 |
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50 µl |
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5 µl |
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工作溶液 |
150 µl |
150 µl |
150 µl |
195 µl |
195 µl |
195 µl |
表2 1 ml比色杯测定的加样比例 (检测范围10~1200 µmol/L)
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培养基或低甘油浓度样品测定 |
高甘油浓度样品测定 |
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空白管 |
标准管 |
样本管 |
空白管 |
标准管 |
空白管 |
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蒸馏水/生理盐水 |
200 µl |
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50 µl |
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